明日预告×
下期预告√ #文献阅读 #疼痛学基础研究 #神经免疫
（越来越懒）
https://www.nature.com/articles/s41467-021-22841-6
Nociceptive sensory neurons promote CD8 T cell responses to HSV-1 infection
伤害感受神经元 促进 CD8+T细胞对HSV-1感染的免疫反应
* HSV-1感染，已知其对神经系统（nociceptors）的调节，但Nociceptors对HSV-1免疫反应的调节作用未知。
* 本研究：
* 皮肤HSV-1感染的 小鼠模型，2 phases的急性病毒复制
* keratinocytes （复制！）→感觉神经元的外周末梢→神经节→（轴突传输，顺向）很多轴突→神经支配部分的皮肤病损（复制！）
* 研究目的：通过在大部分nociceptors都被敲掉的小鼠模型（Nav 1.8 -DTA）中 监测 固有免疫、适应性免疫 对HSV-1的早期反应，探究伤害感觉神经元nociceptor在抗病毒免疫中的作用
** 这种小鼠缺乏某些神经元亚群，对病毒二次复制有影响。本研究，用缺乏thymidine kinase的HSV-1，只在皮肤复制，不在神经中复制，从而消除这种影响。
* 研究结论：nociceptors限制了皮肤HSV-1感染的炎症性cytokine 的产生，限制了中性粒的浸润，促进了组织恢复。这种调控，在皮肤dLN的DC引导CD8+T细胞的过程中，是必须的。
Results
a TK-的HSV-1病毒，和野生型HSV-1病毒，在小鼠皮肤中的滴度titres 相同，即复制的第一期并没有影响。（两种病毒差不多）
b Nav1.8-TdTomato 小鼠皮肤的免疫荧光。Nav1.8是自带的荧光，CD45是染的——证明这个模型中免疫细胞上面没有Nav1.8——所以Nav1.8-DTA就可以用来研究Nav1.8的免疫调节作用啦
（注： diphtheria toxin subunit A, DTA是一种靶向消融某种基因的可靠方法）
cde 敲掉Nav1.8（即没有nociceptors的）鼠感染HSV-1皮肤症状更严重、留疤更严重
用这种HSV-OVA-TK− 病毒去验证
f 两种鼠的皮肤病毒载量差不多。
感染6天后的皮肤-流式：缺少nociceptors的小鼠，在HSV1感染后，有更高水平的中性粒浸润
a CD45+细胞的tSNE分析（即“原始”数据）
（注：T-Distributed random Neighbor embedded (tSNE)是一种降维算法，它允许在保持数据结构的同时，在更小的维数下实现复杂多维数据的可视化。）
（之前忘记的注：CD45：白细胞共同抗原）
b 如何给a分类的策略树（流程图），按箭头方向分别是DC（分为LC、cDC1、cDC2）、类淋巴细胞（分为CD4+T和γδT）和其他→分为肥大细胞和CD11b+→分为中性粒、嗜酸性、单核/巨噬细胞
c 用b给a分类后的结果
def 敲掉Nav1.8的小鼠中性粒多
感染6天后的皮肤-流式：（之前ELISA做出来增加的前三个）炎症细胞因子的来源
ab是看单个细胞表达的增加量
cd是看表达增加的总量
ac：敲掉Nav1.8的小鼠，单核细胞表达TNF-α、IL-6、IL-1b增加
cd：敲掉Nav1.8的小鼠，中性粒单个表达不增加，但是细胞量增加所以总量也增加
Nociceptors：下调单核细胞产生的炎症性细胞因子，限制中性粒的皮肤浸润，从而限制了HSV-1感染后TNF-α、IL-6、IL-1b的水平
没有nociceptors，CD8+T细胞对HSV-1的免疫反应就不太行
a PGP9.5染神经末梢，CD3染T细胞。具体看图。
b 其实是Fig3流式的结果，分析cDC1、cDC2、LC在两种鼠HSV-1皮肤中的绝对数目。cDC2没啥统计意义，cDC1、LC都是Nav1.8-DTA小鼠少
** 既往研究：HSV-1感染后，皮肤DC将抗原转移递呈给LN的DC→T细胞活化。本研究：Nav1.8-DTA小鼠和对照组相比，LN的各种DC分布其实没啥区别（补充图）
** DC没区别，作者就问，DC启动的T细胞反应有没有区别呢？
cd 体外的细胞实验：从肱、腋LN分离纯化的DC（这一部分是体内的），是否能在体外激活naive CD8 T cells（本研究用的是labelled OVA-specific CD8 T cells isolated from OT-I transgenic mice）
c 如果给外源性的OVA肽，那就差不多都可以激活（表示DC→T，这个激活过程没有任何问题，产品合格）
d 如果不给，那Nav1.8-DTA的小鼠就不太行
ef 与cd类似，看DC→激活T细胞，不过是进一步的体内实验。
体外方法是共同培养，体内方法是adoptive (cell) transfer procedure
https://www.jove.com/v/10504/adoptive-cell-transfer-introducing-donor-mouse-splenocytes-to-host
Nav1.8-DTA和对照组小鼠都收到了5w个同种CD45.1+ OT-I T cells。HSV-1感染后D4和D8，测测dLN和脾脏这些T细胞的激活情况：
Nav1.8-DTA不太行
** 两种鼠皮肤的T细胞激活情况没啥区别
机制：nociceptors→中性粒↓→皮损↓、CD8T细胞↑
a 感染HSV-1后皮肤中中性粒的绝对数量，没有nociceptors的中性粒降不下去。（补充图：单核、巨噬就没有这种pattern）
bc 第6天，HIF-1α（低氧诱导因子1-α，与 低氧时中性粒凋亡抑制 相关的一种转录因子）表达没有差异、DAPI（染核）也没有差异，表明a的差异并非来源于细胞的死亡/凋亡数量不同——而是来自有新的中性粒细胞加入了！
defg 用anti-Ly6G-depleting antibody 或 an isotype control (IC) antibody去耗竭中性粒……
d 流式：真的耗竭了中性粒
ef 皮肤病损减小到对照组水平（D7小小差异除外啦）
g dLN、脾脏DC→T细胞，那种不太行的感觉也消失了，在腋LN甚至一转攻势！
另外还做了另一个模型：不是HSV-1病毒感染，ko no 皮肤接种模型da！
ovalbumin in complete Freund’s adjuvant (CFA), which is commonly used to mimic microbial infections, skin inflammation and to induce a strong immune response
没做出来CD8+T细胞变弱的那个结果
刚才忘记的注：肱、腋LN就是前后文提到的dLN，引流部位淋巴结
Introduction
近期研究发现，在感染性疾病中，除免疫系统外，神经系统也有重要作用。
* 免疫系统
* 皮肤“哨兵”：巨噬、DC、肥大、T细胞→免疫反应 召唤其他细胞
* 中性粒 从血液中迁徙而来：杀伤病原、生成cytokines, chemokines and proteolytic enzymes →召唤激活其他细胞
* DC：抗原提呈给皮肤dLN里的 naive T cells
* 神经系统
* Nociceptors：炎症和感染过程中，pathogen-derived molecules, lipids and immune cell-derived mediators 与其上受体结合，改变其兴奋性，增加AP
* 包括ATP、前列腺素、白三烯等
* 信号转导到脊髓，在传达给脑处理，产生痛觉感知
** 神经系统对病原的反应时间以毫秒记，而免疫系统要花上数小时至数天
** 神经系统→免疫系统，既往研究，模型不同，促炎和抗炎都有