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nature.com/articles/s41467-021
Nociceptive sensory neurons promote CD8 T cell responses to HSV-1 infection
伤害感受神经元 促进 CD8+T细胞对HSV-1感染的免疫反应

Introduction
近期研究发现,在感染性疾病中,除免疫系统外,神经系统也有重要作用。
* 免疫系统
* 皮肤“哨兵”:巨噬、DC、肥大、T细胞→免疫反应 召唤其他细胞
* 中性粒 从血液中迁徙而来:杀伤病原、生成cytokines, chemokines and proteolytic enzymes →召唤激活其他细胞
* DC:抗原提呈给皮肤dLN里的 naive T cells

* 神经系统
* Nociceptors:炎症和感染过程中,pathogen-derived molecules, lipids and immune cell-derived mediators 与其上受体结合,改变其兴奋性,增加AP
* 包括ATP、前列腺素、白三烯等
* 信号转导到脊髓,在传达给脑处理,产生痛觉感知
** 神经系统对病原的反应时间以毫秒记,而免疫系统要花上数小时至数天
** 神经系统→免疫系统,既往研究,模型不同,促炎和抗炎都有

* HSV-1感染,已知其对神经系统(nociceptors)的调节,但Nociceptors对HSV-1免疫反应的调节作用未知。

* 本研究:
* 皮肤HSV-1感染的 小鼠模型,2 phases的急性病毒复制
* keratinocytes (复制!)→感觉神经元的外周末梢→神经节→(轴突传输,顺向)很多轴突→神经支配部分的皮肤病损(复制!)
* 研究目的:通过在大部分nociceptors都被敲掉的小鼠模型(Nav 1.8 -DTA)中 监测 固有免疫、适应性免疫 对HSV-1的早期反应,探究伤害感觉神经元nociceptor在抗病毒免疫中的作用
** 这种小鼠缺乏某些神经元亚群,对病毒二次复制有影响。本研究,用缺乏thymidine kinase的HSV-1,只在皮肤复制,不在神经中复制,从而消除这种影响。
* 研究结论:nociceptors限制了皮肤HSV-1感染的炎症性cytokine 的产生,限制了中性粒的浸润,促进了组织恢复。这种调控,在皮肤dLN的DC引导CD8+T细胞的过程中,是必须的。

Results
a TK-的HSV-1病毒,和野生型HSV-1病毒,在小鼠皮肤中的滴度titres 相同,即复制的第一期并没有影响。(两种病毒差不多)
b Nav1.8-TdTomato 小鼠皮肤的免疫荧光。Nav1.8是自带的荧光,CD45是染的——证明这个模型中免疫细胞上面没有Nav1.8——所以Nav1.8-DTA就可以用来研究Nav1.8的免疫调节作用啦
(注: diphtheria toxin subunit A, DTA是一种靶向消融某种基因的可靠方法)
cde 敲掉Nav1.8(即没有nociceptors的)鼠感染HSV-1皮肤症状更严重、留疤更严重
用这种HSV-OVA-TK− 病毒去验证
f 两种鼠的皮肤病毒载量差不多。

各种炎症因子(@皮肤)的ELISA,表明要限制HSV-1感染后诱导的皮肤炎症反应,nociceptors是必需的。

Follow

感染6天后的皮肤-流式:缺少nociceptors的小鼠,在HSV1感染后,有更高水平的中性粒浸润

a CD45+细胞的tSNE分析(即“原始”数据)
(注:T-Distributed random Neighbor embedded (tSNE)是一种降维算法,它允许在保持数据结构的同时,在更小的维数下实现复杂多维数据的可视化。)
(之前忘记的注:CD45:白细胞共同抗原)

b 如何给a分类的策略树(流程图),按箭头方向分别是DC(分为LC、cDC1、cDC2)、类淋巴细胞(分为CD4+T和γδT)和其他→分为肥大细胞和CD11b+→分为中性粒、嗜酸性、单核/巨噬细胞

c 用b给a分类后的结果

def 敲掉Nav1.8的小鼠中性粒多

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感染6天后的皮肤-流式:(之前ELISA做出来增加的前三个)炎症细胞因子的来源
ab是看单个细胞表达的增加量
cd是看表达增加的总量

ac:敲掉Nav1.8的小鼠,单核细胞表达TNF-α、IL-6、IL-1b增加
cd:敲掉Nav1.8的小鼠,中性粒单个表达不增加,但是细胞量增加所以总量也增加

Nociceptors:下调单核细胞产生的炎症性细胞因子,限制中性粒的皮肤浸润,从而限制了HSV-1感染后TNF-α、IL-6、IL-1b的水平

没有nociceptors,CD8+T细胞对HSV-1的免疫反应就不太行

a PGP9.5染神经末梢,CD3染T细胞。具体看图。

b 其实是Fig3流式的结果,分析cDC1、cDC2、LC在两种鼠HSV-1皮肤中的绝对数目。cDC2没啥统计意义,cDC1、LC都是Nav1.8-DTA小鼠少

** 既往研究:HSV-1感染后,皮肤DC将抗原转移递呈给LN的DC→T细胞活化。本研究:Nav1.8-DTA小鼠和对照组相比,LN的各种DC分布其实没啥区别(补充图)
** DC没区别,作者就问,DC启动的T细胞反应有没有区别呢?

cd 体外的细胞实验:从肱、腋LN分离纯化的DC(这一部分是体内的),是否能在体外激活naive CD8 T cells(本研究用的是labelled OVA-specific CD8 T cells isolated from OT-I transgenic mice)
c 如果给外源性的OVA肽,那就差不多都可以激活(表示DC→T,这个激活过程没有任何问题,产品合格)
d 如果不给,那Nav1.8-DTA的小鼠就不太行

ef 与cd类似,看DC→激活T细胞,不过是进一步的体内实验。
体外方法是共同培养,体内方法是adoptive (cell) transfer procedure
jove.com/v/10504/adoptive-cell
Nav1.8-DTA和对照组小鼠都收到了5w个同种CD45.1+ OT-I T cells。HSV-1感染后D4和D8,测测dLN和脾脏这些T细胞的激活情况:
Nav1.8-DTA不太行
** 两种鼠皮肤的T细胞激活情况没啥区别

机制:nociceptors→中性粒↓→皮损↓、CD8T细胞↑

a 感染HSV-1后皮肤中中性粒的绝对数量,没有nociceptors的中性粒降不下去。(补充图:单核、巨噬就没有这种pattern)

bc 第6天,HIF-1α(低氧诱导因子1-α,与 低氧时中性粒凋亡抑制 相关的一种转录因子)表达没有差异、DAPI(染核)也没有差异,表明a的差异并非来源于细胞的死亡/凋亡数量不同——而是来自有新的中性粒细胞加入了!

defg 用anti-Ly6G-depleting antibody 或 an isotype control (IC) antibody去耗竭中性粒……
d 流式:真的耗竭了中性粒
ef 皮肤病损减小到对照组水平(D7小小差异除外啦)
g dLN、脾脏DC→T细胞,那种不太行的感觉也消失了,在腋LN甚至一转攻势!

另外还做了另一个模型:不是HSV-1病毒感染,ko no 皮肤接种模型da!
ovalbumin in complete Freund’s adjuvant (CFA), which is commonly used to mimic microbial infections, skin inflammation and to induce a strong immune response
没做出来CD8+T细胞变弱的那个结果

刚才忘记的注:肱、腋LN就是前后文提到的dLN,引流部位淋巴结

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